蛋白纯化步骤（纯化蛋白质的方法）

今天给大家分享一个关于蛋白质提纯步骤的问题(提纯蛋白质的方法)。以下是这个问题的总结。让我们来看看。

蛋白过镍柱纯化的原理和步骤是什么

镍柱中的氯化镍可以与带有HIs(组蛋白)标签的蛋白质或咪唑结合。

步骤如下:过柱前可选择Ni柱进行再生，即氯化镍倒入柱中，柱的体积会变慢，然后柱会用自身的缓冲液进行平衡，为蛋白质提供最适宜的环境。我通常平衡四根柱子，然后对蛋白质进行取样。你可以让他自己挂柱子。如果流速太慢，可以加一个恒流泵，但是清除一定不能太快。挂了以后，按理说你的蛋白质在Ni柱里和Ni结合了，大部分杂蛋白在烧杯里，留下来了。当然也有少量的杂蛋白。这时候你就需要梯度洗脱了，把咪唑和你的缓冲液匹配起来，一般是0.20 mm到40 mm。100mM洗脱(当你不知道你的蛋白什么时候出来的时候)我指的是咪唑的最终浓度。咪唑加入后，会与白头黑鱼争夺与镍的结合位点。杂蛋白和目标蛋白将以不同的浓度洗脱。洗完之后可以用200mM咪唑洗柱，所有的蛋白都可以洗干净，再平衡几次。再生与否由你决定~那就放20%乙醇救柱吧~

将处理后的蛋白质收集在不同的试管中，然后SDS-page检测它在哪个试管中。

这是我的经验，楼主可以参考别人很多方法。喜欢推荐我的答案，~ \\ (≧▽≦)/~

蛋白质纯化的程序

分离纯化特定蛋白质的一般过程可分为三个步骤:预处理、粗分类和细分类。

预处理

为了分离和纯化蛋白质，首先，蛋白质应该以溶解状态从原始组织或细胞中释放出来，并保持其原始的自然状态而不丧失其生物活性。因此，动物原料应先去除结缔组织和脂肪组织，种子原料应先去除外壳甚至种皮，以避免单宁等物质的污染，油料种子应先用乙醚等低沸点有机溶剂脱脂。然后根据不同的情况，选择合适的方法，使手稿复制出组织和细胞。动物组织和细胞可以通过电动捣碎器或匀浆器或通过超声波处理来粉碎。因为植物组织和细胞具有由纤维素、半纤维素和果胶组成的细胞壁，所以一般需要用适当的提取物研磨石英砂或玻璃粉或用纤维素酶处理。打破细菌细胞比较麻烦，因为整个细菌细胞壁的骨架其实是肽聚糖的一种囊性大分子，通过共价键非常坚韧。破碎细菌细胞壁的常用方法包括超声波破碎、砂磨、高压挤压或溶菌酶处理。组织和细胞破碎后，选择合适的缓冲液提取所需的蛋白质。不溶性物质如细胞碎片通过离心或过滤去除。

如果所需蛋白质主要集中在某一种细胞成分中，如细胞核、染色体、核糖体或可溶性细胞质，则可以通过差速离心的方法将它们分离出来，收集该细胞成分作为下一步的纯化材料。如果所需的蛋白质与细胞膜或膜细胞器结合，膜结构必须通过超声波或去污剂解聚，然后通过合适的介质提取。

粗分离

当蛋白质提取物(有时混有核酸、多糖等。)，选择合适的方法将所需蛋白质与其他杂质分离。通常，在该步骤中使用盐析、等电点沉淀和有机溶剂的分级分离。这些方法的特点是简单、处理量大，既能去除大量杂质，又能浓缩蛋白溶液。一些蛋白质提取物体积大，不适合通过沉淀或盐析来浓缩。超滤、凝胶过滤、冷冻干燥或其他方法可用于浓缩。

精细分离

经过粗分类和分离后，样品一般体积较小，大部分杂质已被去除。为了进一步纯化，常用的色谱法包括凝胶过滤、离子交换色谱法、吸附色谱法和亲和色谱法。如果需要，电泳，包括区带电泳和等电聚焦，也可以选择作为最终的纯化步骤。用于细分级别分离的方法通常规模小，但分辨率高。

结晶是蛋白质分离和纯化的最后一步。虽然结晶过程并不能保证蛋白质一定是同质的，但只有当某种蛋白质在溶液中具有数量优势时，才能形成结晶。结晶过程本身伴随着一定程度的纯化，重结晶可以去除少量的混合蛋白。因为在结晶过程中从未发现过变性蛋白质，蛋白质的结晶不仅是纯度的象征，也是判断产品是否处于自然状态的有力指标。

离子色谱法

蛋白质纯化离子交换层析有试剂和离子交换剂。当分离的蛋白质溶液流过离子交换层析柱时，与离子交换剂电荷相反的蛋白质被吸附在离子交换剂上，然后通过改变pH或方法将吸附的蛋白质洗脱。

有机溶剂萃取

蛋白质纯化有机溶剂萃取的原理是，与水互溶的有机溶剂(如甲醇、乙醇)能显著降低某些蛋白质在水中的溶解度；而且在一定的温度、pH值、离子强度下，引起蛋白质沉淀的有机溶剂浓度是不同的。因此，可以通过控制有机溶剂的浓度来分离和纯化蛋白质。如在冰浴磁力搅拌下，向4℃预冷的培养液中缓慢加入乙醇(-25℃)，可使冰核蛋白沉淀，从而纯化冰核蛋白。因为在室温下，有机溶剂不仅会造成蛋白质沉淀，还会伴随变性。因此，通常需要冷却有机溶剂，然后在不断搅拌下加入有机溶剂，以防止局部浓度过高，这样就可以在很大程度上解决蛋白质变性的问题。一些蛋白质与脂质紧密结合，或者在其分子中具有许多极性侧链，它们不溶于水。它们可以用有机溶剂如乙醇、丙酮和丁醇提取。这些溶剂具有一定的亲水性和较强的亲油性，是理想的萃取溶液。Cohn于1949年首次提出用冷乙醇分离提取免疫球蛋白，用于制备丙种球蛋白。冷乙醇法也是世卫组织法规和中国生物制品法规推荐的方法，不仅分辨率高，纯化效果好，而且可以同时分离多种成分，具有抑菌、去病毒、去病毒的作用。

蛋白质的分离纯化

蛋白质的分离纯化方法如下:

一、根据蛋白质溶解度不同的分离方法。

1.蛋白质的盐析法:中性盐对蛋白质的溶解性有显著影响。一般在低盐浓度下，蛋白质的高弯曲溶解度随着盐浓度的增加而增加，称为盐溶解；当盐浓度继续增加时，蛋白质的溶解度不同程度地降低，并相继沉淀，这就是所谓的盐析。

2.等电点沉淀法:蛋白质处于静电状态时，粒子间的静电斥力最小，所以溶解度最小。各种蛋白质的等电点不同。可以通过调节溶液的ph值达到蛋白质的等电点来沉淀，但这种方法很少单独使用，可以与盐析法结合使用。

3.低温有机溶剂沉淀法:使用与水混溶的有机溶剂，如甲醇、乙醇或丙酮，可以降低大部分蛋白质的溶解度，使其沉淀。这种方法的分辨率比盐析高，但是蛋白质容易发生变化，所以要在低温下进行。

第二，根据蛋白质分子大小的不同进行分离的方法。

1.透析和超滤:透析是用半透膜分离不同分子大小的蛋白质。圆稿超滤法是利用高压或离心力迫使水和其他溶质分子通过半透腔，而蛋白质则留在膜上。可以选择不同孔径的滤膜来截留不同分子量的蛋白质。

2.凝胶过滤法:

也称为分子排阻色谱或分子筛色谱，是根据分子大小分离蛋白质混合物的最有效方法之一。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝胶和琼脂糖凝胶。

第三，根据蛋白质的带电性质进行分离。

1.电泳:在相同的ph条件下，各种蛋白质由于分子量和电荷不同，在电场中的迁移率不同，可以被分离。值得关注的是等电聚焦电泳。

本文以两性电解质为载体。在电泳过程中，两性电解质从正极到负极形成逐渐增大的ph梯度。带一定电荷的蛋白质在里面游动，到了等电点就停止了。该方法可用于分析和制备各种蛋白质。

2.离子交换色谱:离子交换剂包括阳离子交换剂(如羧甲基纤维素；Cm-纤维素)和阴离子交换剂(二乙氨基乙基纤维素)。当分离出的蛋白质溶液流经离子交换层析柱时，与离子交换剂电荷相反的蛋白质被吸附在离子交换剂上，然后通过改变ph或离子强度将吸附的蛋白质洗脱下来。

纯化蛋白质的方法

纯化蛋白质的方法包括沉淀、电泳、透析、层析和超速离心。

1.降水。

2.电泳:蛋白质在高于或低于其等电点的溶液中带电，在电场中可以向电场的正极或负极移动。根据支持物的不同，有薄膜电泳、凝胶电泳等。

3.透析:用透析袋将大分子蛋白质与小分子化合物分离的方法。

4、色谱法:

a、离子交换层析，利用蛋白质的两性自由性质，在一定的PH值下，每种蛋白质具有不同的电荷和性质，因此可以用离子交换层析分离。如阴离子交换层析，负电荷小的蛋白质先被洗脱。

b、分子筛，又称凝胶过滤。蛋白质这种小分子进入洞穴后停留时间长，而蛋白质这种大分子不能及时进入洞穴，直接流出。

5.超速离心:可用于分离纯化蛋白质，测定蛋白质的分子量。不同蛋白质通过它们不同的密度和形状来区分。

纯化蛋白质的注意事项:

1.为了避免蛋白质变性，不要剧烈搅拌样品和反复冻融。

2.缓冲溶液的组成尽可能模拟细胞的内环。

3.为避免蛋白质氧化，在缓冲溶液中加入0.1 ~ 1 mmol/LDTT(二硫苏糖醇)(或β-巯基乙醇)。

4.为了避免重金属对目的蛋白的破坏，加入1 ~ 1 ~ 10 mmol/l的金属螯合剂。

5、为了避免微生物滋生，使用灭菌溶液。在纯化任何一种蛋白质时，都要时刻注意它的稳定性，保护它的活性。我们需要记住以下一般注意事项。

6、尽量在冰上或冷库中操作。

7.蛋白质浓度不能太稀。

8.除非是聚焦层。否则pH值要合适，防止缓冲液pH值与pI相同，避免蛋白质沉淀。

9.使用蛋白酶抑制剂，避免蛋白酶对目标蛋白的降解；在胞内蛋白的纯化中，加入dnase降解DNA，避免DNA对蛋白的污染。

蛋白质分离纯化的四种方法

1、盐析法:

盐析法的基础是蛋白质在稀盐溶液中的溶解度会随着盐浓度的增加而增加，但当盐浓度增加到一定值时，水分活度会降低，导致蛋白质分子表面电荷逐渐中和，水合膜逐渐破坏，最终导致蛋白质分子从溶液中相互凝聚沉淀。

2、有机溶剂沉淀法:

有机溶剂能降低蛋白质溶解度的原因有两个:一是与盐溶液具有相同的脱水效果；其次，正、有机溶剂的介电常数低于水，导致溶剂极性降低。

3、蛋白质沉淀剂:

蛋白质沉淀剂只作用于一种或一种蛋白质沉淀，如碱性蛋白、凝集素、重金属等。

4、聚乙二醇沉淀:

水溶性非离子聚合物如聚乙二醇和葡聚糖硫酸钠能沉淀蛋白质。

扩展数据:

蛋白质是生命的物质基础，是有机大分子，是构成细胞的基本有机物质，是生命活动的主要承担者。没有蛋白质就没有生命。氨基酸是蛋白质的基本成分。它是一种与生命和各种形式的生命活动密切相关的物质。

蛋白质参与了身体的每个细胞和所有重要组成部分。蛋白质的烂啤酒占人体体重的16%~20%，即一个体重60kg的成年人，体内约有9.6~12kg的蛋白质。

人体内的蛋白质种类繁多，性质和功能各异，但都是由20多种不同比例的氨基酸组成，在体内不断代谢更新。

百度百科-蛋白质分离与纯化

蛋白质纯化步骤的介绍到此结束。感谢您花时间阅读本网站的内容。不要忘记在这个网站上找到更多关于纯化蛋白质的方法和蛋白质纯化步骤的信息。

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