溶血性链球菌!（什么是溶血性链球菌!）

溶血性链球菌！(什么是溶血性链球菌！)

链球菌普遍存在于各种动物中，大多数是宿主特异性的，不同的菌株感染不同种类的动物。链球菌可引起一系列疾病，包括脑膜炎、败血症、多发性浆膜炎、关节炎、心内膜炎和肺炎。鼻炎链球菌和流产病例也已被隔离，说明也与这两种疾病有关。链球菌感染的发病率和严重程度因地区而异。链球菌血清型众多，其中猪链球菌至少有34种血清型。它们的致病性和临床症状不同，同一血清型在不同情况下的致病性和临床症状也不同。有些血清型主要分离自健康猪，无致病性；有的主要引起肺损伤；有些能感染猪和其他动物。一些血清型，主要是2型，不仅能引起猪脑膜炎，偶尔也能引起人脑膜炎。

1致病特征

1.1形态学和染色

链球菌呈球形或卵圆形，直径0.6 ~ 1.0μ m，呈链状排列。短的由4 ~ 8个细菌组成，长的由20 ~ 30个细菌组成。链条的长短与细菌的种类和生长环境有关。在液体介质中倾向于长链，在固体介质中倾向于短链。因为链球菌能产生熔解酶，所以正常情况下链球菌的链不能无限延长。大多数菌株在血清肉汤中培养2 ~ 4h，容易形成透明质酸胶囊。连续培养后，胶囊可被细菌产生的透明质酸酶分解而消失。这种细菌不形成孢子，没有鞭毛，容易被常见的碱性染料染色，呈革兰氏阳性(图2-4)。经过长期培养或被中性粒细胞吞噬后，转为革兰氏阴性。

1.2文化特征

需氧或兼性厌氧菌，对营养要求高，在普通培养基上生长不好，需要补充血清、血液、葡萄糖才能生长。最适生长温度为37℃，可在20 ~ 42℃生长，最适pH为7.4 ~ 7.6。在血清肉汤中易形成长链，管底呈絮状或颗粒状。在血平板上形成灰色、半透明、表面光滑、边缘整齐、直径0.5 ~ 0.75 mm的微小菌落，不同菌株有不同的溶血现象(图2-5)。

1.3生化反应

它能分解葡萄糖，产酸不产气，分解乳糖、甘露醇、水杨苷、山梨醇、棉子糖、海藻糖和七叶皂苷的能力因菌株不同而异。一般菊粉不分解，不被胆汁溶解，接触酶试验阴性。

1.4抗原结构

链球菌的抗原结构复杂，主要有三种类型:

(1)核蛋白抗原，或P抗原，是非特异性的，各种链球菌都一样，与葡萄球菌交叉。

(2)多糖抗原，或称C抗原，是一种群特异性抗原，是细胞壁的多糖成分，可用稀盐酸提取。利用多糖抗原，链球菌可根据Lancefield血清学分类分为许多群。目前有A、B、C、D、E、F、G、H、K、L、M、N、O、P、Q、R、S、T、U19等19个血清群，每个血清群又有几个血清型。根据荚膜抗原的特性，猪链球菌可分为35个血清型，即1 ~ 34个血清型和1/2血清型同时含有1型和2型抗原。

(3)蛋白抗原或表面抗原，具有类型特异性，位于多糖抗原外层，可分为M、T、R和S4抗原，性质不同。m抗原与致病性有关。m抗原具有抗吞噬作用，使链球菌易于粘附上皮细胞。根据M抗原的不同，A群链球菌可分为60多种血清型。r、T、S抗原与致病性和毒力关系不大，但可用于链球菌分型。

1.5分类

根据链球菌在血液培养基上生长繁殖后是否溶血及其溶血特性，可将链球菌分为三类。

1.5.1 α溶血性链球菌

菌落周围有1 ~ 2mm宽的草绿色溶血环，又称溶血性链球菌A，多为条件致病菌。

1.5.2 β溶血性链球菌

在菌落周围形成一个宽2 ~ 4 mm、边界清晰、完全透明的无色溶血环，又称溶血性链球菌b，这种细菌又称为溶血性链球菌，致病性很强，常引起人和动物的多种疾病。

1.5.3 γ链球菌

不产生溶血素，菌落周围无溶血环。也叫C型或非溶血性链球菌。这种细菌是非致病性的，经常存在于牛奶和粪便中，偶尔会引起人类或动物感染。

1.6阻力

这种细菌的抵抗力一般较弱，60℃30分钟即可杀灭。它对普通消毒剂很敏感，在干燥的灰尘中可以存活几个月。B型链球菌对青霉素、红霉素、氯霉素、四环素和磺胺敏感。β-内酰胺类药物是链球菌感染的首选药物。

2流行病学特征

链球菌在自然界分布广泛。它存在于水、空空气、灰尘、粪便以及健康人和动物的口腔、鼻腔和咽喉中。可通过直接接触、空空气飞沫或通过皮肤黏膜伤口感染。肉、蛋、奶及其制品等被污染的食物也会感染人类。人和动物的上呼吸道感染和化脓性感染部位的患者常成为食品污染的污染源。

3危害

链球菌种类繁多，其中猪链球菌与人类关系密切。在众多的猪链球菌血清型中，猪链球菌2型是猪最重要的病原，致病性最强。链球菌的致病性与溶菌酶释放蛋白、细胞外蛋白因子、溶血素等毒力因子有关。

在中国，2005年，四川部分地区爆发猪链球菌2型，导致200多人感染，38人死亡。在荷兰，屠宰场的工人和饲养员每年患猪链球菌脑膜炎的比率约为3/10万，是不在屠宰场工作的人的1500倍。屠夫患猪链球菌脑膜炎的比率为1.2/10万。在德国，屠夫、屠宰场工人、肉类加工厂工人是猪链球菌定居鼻咽的高危人群。在新西兰，1980年后的研究表明，9%的奶农、10%的肉类检验员和21%的养猪户的猪链球菌2型血清呈阳性，表明部分人群存在亚临床感染。

4检测方法

包括病原体的分离和鉴定方法、分子生物学方法、免疫学方法如ELISA。

4.1分离和识别方法

样品处理

取25g(或25mL)待测样品，加入225mL灭菌生理盐水制成悬浮液。

4.1.2接种培养

吸取5mL悬液接种于50mL葡萄糖肉膏肉汤中，或直接划线于血平板上(若待测样品污染严重，可同时接种5mL于匹克氏肉汤中)，36℃孵育24h，接种于血平板上，36℃孵育24h，搅起B溶血圆形突起的微小菌落，在血平板上纯化。观察液体和固体中的培养特性、溶血、革兰氏染色和形态学，进行循环磷酸。

营地测试

在血琼脂平板上用金黄色葡萄球菌培养画一条直线，再用链球菌培养画一条线，与金黄色葡萄球菌培养线垂直，但不要互相接触。它们之间的距离为3 ~ 5 mm，链球菌分离株的行距为10 ~ 20 mm，37℃孵育24h后观察结果。两线交界处箭头形溶血区为阳性。

链激酶试验

吸取0.2mL草酸钾血浆，加入0.8mL灭菌生理盐水，混匀，然后加入0.5mL链球菌36℃18 ~ 24h的肉浸肉汤培养物和0.25ml 0.25%氯化钙，混匀，36℃水浴10min，血浆混合物自行凝固。再次观察血块完全溶解的时间，完全溶解后为阳性，24h后不溶解为阴性。同时以肉膏肉汤为阴性对照，以已知链激酶阳性菌株为阳性对照。

4.1.5杆菌肽的敏感性试验

将典型菌落的菌液涂于血平板上，用灭菌镊子夹取每张含0.04U的杆菌肽纸置于上述平板上，36℃培养18 ~ 24h。如果有抑菌圈，则为阳性。已知的阳性菌株用作对照。

4.2分子生物学方法

挑取单个可疑菌落，接种于鲁利亚-贝尔塔尼(LB)肉汤中，37℃摇匀过夜，将1.0mL菌悬液置于1.5mL离心管中，用冷冻离心机以12000r/min离心10min，弃去上清液，加入1.0mL灭菌双蒸水，摇匀制成菌悬液，水浴煮沸10min和3000r/min。上游引物为:5′-gtacagttgcttcagcacgtatc-3′，下游引物为:5′-ACGTTCGATTCATCACGTT-3′。反应体系:10×buffer5μL，TaqDNA聚合酶(5U/μL)1μL，MgCl2溶液(25mmol/L)3μL，dNTP(2.5mmol/L)4μL，上游引物(10μmol/L)1μL，下游引物(10μ mol/l) 1μ l，反应条件为:95℃预变性5min，94℃变性1min，59℃退火1min，72℃延伸45sPCR产物用1.5%琼脂糖在100V下电泳，扩增长度为197bp的扩增产物对链球菌呈阳性。

4.3酶联免疫吸附试验

涂层

用0.05mol/LpH9.0碳酸盐包被缓冲液，稀释抗体至蛋白含量1 ~ 10μ g/ml。向每个聚苯乙烯板的反应孔中加入0.1mL抗体，4℃过夜。第二天，丢弃孔中的3min溶液，用洗涤缓冲液洗涤3次，每次3分钟(以下简称洗涤)。

样品添加

向包被的反应孔中加入0.1mL稀释的菌液，37℃孵育1h。然后洗(同时做空白洞、阴性对照孔、阳性对照孔)。

4.3.3加入酶标抗体。

向每个反应孔中加入0.1mL新鲜稀释的酶标抗体(滴定后稀释)。37℃孵育0.5 ~ 1h，洗涤。

4.3.4加入显色底物液

向每个反应孔中加入0.1mL临时制备的TMB底物溶液，在37℃孵育10～30分钟。

4.3.5终止反应

在每个反应孔中加入0.05毫升2摩尔/升的硫酸。

结果判断

在白色背景上，肉眼可直接观察到结果:反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应无色或极浅，根据颜色深浅用“+”和“-”表示。可测量的OD值:在ELISA检测器上，在450nm处，用空白色对照孔归零后，测量每个孔的OD值。如果大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，则为阳性。

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