甘露聚糖酶（葡聚糖酶）

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甘露聚糖酶的分子量是多少？

去看看这个地方。不同的菌株有不同的培养方法。

地衣芽孢杆菌NK-27菌株产生的β-甘露聚糖酶经硫酸铵盐析沉淀，经DEAE纤维素和Sephadex G-100离子交换柱层析和PAGE两次制备。通过凝胶电泳获得均匀的样品。SDS-凝胶电泳测得纯化的β-甘露聚糖酶的分子量为26kD，凝胶聚焦电泳测得等电点P1为5.0。酶促反应的最适pH为9.0，最适温度为60℃，

甘露聚糖酶、脂肪酶和其他裂解酶。

木霉可以合成一些裂解酶，包括甘露糖、脂肪酶和磷酸酶(Elad等，1983；Labudova等人，1988年)。

β-D-1，4-甘露聚糖酶是一种能水解甘露寡糖和带有β-D-1，4-糖苷键的甘露聚糖的内切水解酶。它属于半纤维素酶，广泛应用于造纸工业、食品工业和农业。里氏木霉Rut C-30产生的甘露聚糖酶蛋白有五种，其中活性最高的两种酶已被纯化(Arisan-Atac等，1993；斯塔尔布兰德等人，1993年)。后来发现这两种甘露聚糖酶属于基因man1的产物，该基因具有纤维素结合结构域，属于糖苷水解酶的第五家族(Stalbrand等，1995)。里氏木霉甘露聚糖酶基因在酿酒酵母中表达，但酶活性很低。例如，酿酒酵母表达的里氏木霉man1的活性仅为1.3×10-2IU/mL(Aparicio et al .，2002)。魏跃华等(2005)在毕赤酵母中成功表达了木霉甘露聚糖酶基因man1，获得了高分泌表达甘露聚糖酶的基因工程菌株Gpmf25。发酵120h后，重组甘露聚糖酶的活性可达12.5IU/mL，比酿酒酵母表达的里氏木霉甘露聚糖酶高近1000倍。Agrawal等人(2011)将里氏木霉β-甘露聚糖酶的基因转入烟草，促进了木质素生物质的水解。

脂肪酶是一种分解脂肪的酶，是最早研究的酶之一。它能将甘油三酯分解成脂肪酸和甘油或发生逆反应(张淑铮，1984)。微生物脂肪酶是工业脂肪酶的主要来源。戈茨等人(1985)克隆并测序了猪葡萄球菌和金黄色葡萄球菌的脂肪酶基因。此后，不同来源脂肪酶的基因序列和蛋白质一级结构逐渐被阐明。随着基因工程和蛋白质工程的发展，脂肪酶基因表达的调控和蛋白质分子的修饰取得了新的进展。1990年报道了真菌脂肪酶米氏毛霉(RML)和人胰脂肪酶的X射线衍射晶体结构，使脂肪酶的研究进入了结构和功能研究的新阶段。细菌、酵母和霉菌都筛选出了酶活高的菌株(彭，1999)。隋聪颖等(2008)筛选出4株产脂肪酶的木霉菌株，编号为:153-1，13-2，30425，Xi 1-1。根据菌落形态、显微镜观察和ITSrDNA序列分析，4株菌株分别鉴定为哈茨木霉、长枝木霉、哈茨木霉和长枝木霉，其酶活力分别为4.79U/mL、2.41U/mL、5.32U/mL和3。Kashmiri等人(2006)筛选了一种产生脂肪酶的绿色木霉。培养48h后，胞外脂肪酶活性达到7.3U/mL，胞内脂肪酶活性达到320U/g菌丝体。Ulker等人(2011)分离并鉴定了哈茨木霉IDM14D中的脂肪酶活性。该脂肪酶在pH 8.0 ~ 10.0范围内能保持稳定，Ca2+和Mn2+能增强其活性，但其他矿物离子对其活性无明显影响。

磷酸酶是一种能使相应底物脱磷酸的酶，即通过水解磷酸单酯除去底物分子上的磷酸基团，生成磷酸根离子和游离羟基。蛋白磷酸酶和蛋白激酶共同调节细胞内蛋白的可逆磷酸化，参与许多细胞生物学事件的调节，包括细胞分化和信号转导(Stefan et al .，1999)。随着哈茨木霉菌丝体cDNA文库的建立，功能基因的验证成为首要任务。测序获得3298条成功的EST序列(刘等，2007)。刘燕等(2008)从哈茨木霉cDNA文库中克隆了丝/苏氨酸蛋白磷酸酶的全长cDNA序列(PP2A)，并成功构建了原核表达载体，在大肠杆菌BL21中高效表达可溶性蛋白。Asseri等人(2009)分析比较了曲霉、青霉、木霉和假孢霉四种产磷酸酶的菌株，发现哈茨木霉的磷酸酶活性和切割能力最强。雷涛等(2010)从哈茨木霉中分离纯化了一种酸性磷酸酶，分子量为57.8kDa，最适温度为55℃，最适pH为4.8。该酶的活性可被无机磷酸盐部分抑制，被钨酸盐完全抑制。

由于内酯酶在食品工业中的重要性，人们也对木霉菌株的内酯酶进行了研究。内酯酶是完整纤维素酶系的一部分，能水解内酯类化合物的内酯键产生羟基酸。商品里氏木霉制剂中内酯酶的纯化。这种酶在1，5-葡糖酸内酯和纤维二糖内酯存在时有活性(Bruchmann等，1987)。

β-甘露聚糖酶的作用

消除饲料中甘露聚糖对葡萄糖吸收的干扰，大幅度提高豆粕能量消化率，使玉米-豆粕型日粮代谢增加100-150大卡/千克。

甘露聚糖分解产生的甘露寡糖可被动物肠道内的有益菌吸收，改善菌群组成，减少大肠杆菌和沙门氏菌的感染。降低肉鸡球虫病的危害，提高肉鸡的整齐度。

3降低肠道粘度，促进能量、蛋白质和纤维素的消化吸收。

β-甘露聚糖的结构和水解酶

软木的主要半纤维素半乳甘露聚糖以两种形式出现，它们的半乳糖含量不同(Timell，1967)。在低半乳糖形式中，半乳糖、葡萄糖和甘露糖的比例约为0.1∶1∶4；在高半乳糖形式中，比例为1∶1∶3。这两种半乳甘露聚糖的骨架由随机分布的D-吡喃葡萄糖基和D-吡喃葡萄糖基残基通过β-1，4连接而成。α-D-吡喃半乳糖残基通过α-1，6键与骨架中的D-吡喃糖残基相连。骨架中大约每四个六氨基吡啶基团在2或3位被部分乙酰化。乙酰基的迁移类似于木聚糖，因此很难确定它们在天然聚合物中的实际分布。硬木只含有一些葡甘露聚糖。葡甘露聚糖和半乳甘露聚糖的几种结构变体也出现在几种一年生植物中，特别是在种子、块茎和鳞茎中(Aspinall，1959；麦克利里，1979)。

内切β-甘露聚糖酶

内切-β-甘露聚糖酶是一种水解甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡甘露聚糖和半乳甘露聚糖中β-1，4-糖苷键的酶。葡甘露聚糖和半乳甘露聚糖不仅含有甘露糖单元，而且在聚合物主链上还含有葡萄糖单元，可能被特定的内切葡聚糖酶(内切-β-葡萄糖苷酶)水解，对具有甘露聚糖骨架的聚合物没有影响，所以不能称为甘露聚糖酶。

与木聚糖酶相比，对不同木霉种的甘露聚糖酶的研究要少得多，只有哈茨木霉E58和里氏木霉Rut C-30有过报道。一方面，两个物种都产生各种形式的甘露聚糖酶(Torrie等人，1990；Starbrand等人，1993年)。当纤维素或不同的甘露聚糖用作碳源时，木霉能产生甘露聚糖酶。哈茨木霉对半乳甘露聚糖和纤维素的甘露聚糖酶活性几乎相同，但甘露聚糖酶对半乳甘露聚糖的比活性明显更高。另一方面，发现里氏木霉在纤维素存在下比半乳甘露聚糖产生更高的甘露聚糖酶活性(Arisan-Atac等，1993)。然而，真菌不能在半乳甘露聚糖上很好地生长，并且在纤维素和半乳甘露聚糖上产生的每单位生物质的甘露聚糖酶的量是相似的。尚未观察到由甘露聚糖酶诱导的甘露糖或甘露糖合成(Torrie等人，1990；Arisan-Atac等人，1993年)。

唯一被纯化和详细研究的木霉甘露聚糖酶来自里氏木霉Rut C-30(Arisan-Atac等，1993；Starbrand等人，1993年)。在培养滤液中可以检测到至少五种具有甘露聚糖酶活性的酶形式。已经纯化和表征了等电点为4.6和5.4的两种主要酶形式。它们的分子量略有不同，分别为51kDa和53 kda(stal brand等人，1995)。其他两种甘露聚糖酶的蛋白质性质非常相似。氨基酸比较和N端氨基酸序列好像是一样的。Arisan-Atac等(1993)纯化的甘露聚糖酶的pI值为5.2，分子量为46kDa，可能与Stalbrand等(1993)分离的pI为5.2的酶相同。

来自里氏木霉的编码甘露聚糖酶的基因Man1最近被分离并在酿酒酵母中表达。发现来自里氏木霉pI4.6和pI5.4的两种纯化形式的甘露聚糖酶和其它形式的甘露聚糖酶可以由man1基因编码。与此相一致的是，里氏木霉基因组中man1基因的缺失使甘露聚糖酶活性降低至比亲本菌株低10%。不同甘露聚糖酶形式的产生至少部分是由于翻译后修饰(如脱氨基作用)。

根据基因序列，发现里氏木霉甘露聚糖酶与几种纤维素酶具有相似的结构域:催化结构域和由连接肽隔开的CBD。这种酶也强烈结合纤维素，但没有检测到与甘露聚糖的特异性结合。然而，该酶不具有任何纤维素水解活性。基于疏水聚类分析，甘露聚糖酶(MAN I)属于糖基水解酶家族5。该家族由来自变铅青链霉菌、Caldocellulosiruptor saccharolyticus和棘孢曲霉的几种纤维素酶和三种其它甘露聚糖酶组成(Suurnakki等人，1993；Suurnakki等人，1996年)。棘孢曲霉甘露聚糖酶和里氏木霉甘露聚糖酶具有较高的氨基酸序列同源性(70%)，但不含CBD。这两种细菌甘露聚糖酶似乎比真菌甘露聚糖酶彼此更接近，从而表明细菌和真菌的酶活性可能不同。在里氏木霉的甘露聚糖序列中也发现了两个谷氨酸残基(Primalco Biotec，芬兰，未发表的结果)。

10.5.2.2甘露聚糖水解的辅助酶

①β-甘露糖苷酶和β-葡萄糖苷酶。据报道，里氏木霉仅产生非常少量的胞内β-甘露糖苷酶，这可能是真菌在甘露聚糖上生长缓慢的原因(Arisan-Atac等人，1993)。之后就没有对木霉β-甘露糖苷酶进行纯化或进一步研究。甚至真菌也可能不产生任何特异的β-甘露糖苷酶，以对硝基苯-D-吡喃糖苷为底物测得的活性是由于其他外切葡聚糖酶的假活性类似于α-呋喃阿拉伯糖苷酶的β-木糖苷酶活性。β-甘露糖苷酶也可能存在于真菌中，但大多数是胞内的。在这种情况下，随着纤维素酶的生物合成，类似于二葡糖苷酶的质膜结合转运系统可以将甘露聚糖片段转运到细胞中(Kubicek等，1993)。

已知里氏木霉产生至少两种β-葡萄糖苷酶(Barnett等人，1991；陈等，1992)。目前尚未研究这些酶对葡甘露寡糖的水解活性，但用于水解实验的来自其他生物的β-葡萄糖苷酶可以去除这些寡糖非还原端的吡喃葡萄糖残基(Takahashi et al .，1984)。目前尚不确定参与纤维素降解的β-葡萄糖苷酶是否参与半乳甘露聚糖的降解。

(2)α-半乳糖苷酶。筛选在酵母中建立的里氏木霉表达文库，证明里氏木霉至少产生三种α-半乳糖苷酶。已经分离并表征了三种酶(agl1、agl2和agl3)的基因。为了研究它们的催化活性，在酵母AGL III中产生了三种相应的酶(AGL I、AGLII和AGL III)(Margolles-Clark等，1996c)。

在这三种酶中，AGL I对聚半乳甘露聚糖的活性最高。但AGL I的水解度相当低，甘露聚糖酶的存在明显提高了其活性，而β-甘露糖苷酶的加入影响不大。目前，酿酒酵母中产生的里氏木霉α-半乳糖苷酶已被纯化，也有两篇直接从真菌培养基中纯化里氏木霉α-半乳糖苷酶的报道(Zeilinger等，1993；Kachurin等人，1995年)。指出这些α-半乳糖苷酶的分子量和等电点非常相似，分别为50kDa和54kDa以及5.2和5.25，说明这些数据定义了同一种酶。根据分子量和水解特性，纯化的酶与AGL I相同(Zeilinger等，1993；Margolles-Clark等人，1996年d)。AgL I的对硝基苯-a-D-半乳糖苷活性可被半乳糖竞争性抑制。

另一种α-半乳糖苷酶AGL II对聚合底物活性不大，但与甘露聚糖酶表现出协同作用，加入β-甘露糖苷酶后水解度进一步提高。当反应中加入甘露聚糖酶和β-甘露糖苷酶时，AGL ⅲ的活性也有所提高。然而，AgLⅲ的水解度远低于从AgLⅱ获得的水解度(Margolles-Clark等，1996e)。AGL ⅱ和AGL ⅲ与β-甘露糖苷酶有明显的协同作用，表明它们更倾向于选择寡糖非还原末端甘露糖单元有半乳糖取代基的小寡糖作为底物。AGL对对硝基苯-a-D-吡喃半乳糖苷的活性低于蜜二糖(Gala1-6Glc)。这可以解释为什么在里氏木霉Rut C-30的培养滤液中没有发现对硝基苯-a-D-吡喃半乳糖苷，尽管agl3基因似乎被很好地表达(Margolles-Clark等人，1996e)。此外，agl2基因似乎得到了很好的表达，这可以解释为什么aglⅲ没有被首先分离出来。Zeilinger等人(1993)报道了在里氏木霉的培养滤液中存在少量的α-半乳糖苷酶AGL。

一方面，根据AGLⅰ和AGLⅲ推导的氨基酸序列，它们属于糖基水解酶家族27，含有来自植物、动物、酵母和丝状真菌的α-半乳糖苷酶。另一方面，AGLⅹⅱ与细菌α-半乳糖苷酶家族36相似，因此它是第一个报道的与相应原核酶相似的真核α-半乳糖苷酶。Agl ⅲ在N-末端携带230个额外的氨基酸，这在家族27的其他酶中没有发现。这个额外的区域似乎对催化活性并不重要，因此它很可能是不同于迄今为止描述的任何多糖结合结构域的另一个功能结构域。最近，据报道，里氏木霉AGL的活性位点含有催化重要的甲硫氨酸(Kachurin等，1995)。

(3)乙酰葡甘露聚糖酯酶。里氏木霉培养物滤液中半乳甘露聚糖的去糖基化不如葡糖醛酸木聚糖酶有效，并且没有从任何木霉中分离出特异性的乙酰葡甘露聚糖酶(Tenkanen等，1993)。里氏木霉乙酰酯酶(AE)可以从木糖寡糖中释放乙酰基侧基，也可以作用于乙酰化的甘露糖寡糖。报道了来自石竹的乙酰木聚糖酯酶的类似特征(Biely等人，1996)。类似于乙酰木聚糖酯酶在葡糖醛酸中木聚糖的去糖基化中的行为，还发现AE与米曲霉的乙酰葡甘露聚糖酯酶在乙酰化半乳甘露聚糖的水解中协同作用，并且认为观察到的协同作用至少部分是由于去除了半乳糖侧基附近的乙酰基，这可能容易接近乙酰葡甘露聚糖酯酶但不容易接近乙酰葡甘露聚糖酯酶(Tenkanen，1995)。

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